郑 豪 李东亮 朱清海
胃癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，目前其具体发病机制尚不清楚[1]。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是近些年来发现的一类调控型大分子非编码RNA，在多种生命活动中具有调控作用。lncRNA 01287在多种癌组织及癌细胞中高表达，研究发现，lncRNA 01287与乳腺癌较差的临床结局密切相关，而且lncRNA 01287高表达促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度在25 nt范围内的非编码RNA，miR-298在肿瘤中的抑癌作用已被广泛报道，miR-298在甲状腺癌中低表达，甲状腺癌细胞转染miR-298模拟物则可抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡[3]。有研究报道，lncRNA 01287在肝癌中通过负向调控miR-298，从而在肝癌的发生发展中起作用[4]。信号传导和转录激活因子3(signal transducer andactivator of transcription，STAT3)是一种重要的转录因子，在胃癌中高表达，研究发现，miR-298通过靶向作用于STAT3在肝癌细胞的增殖迁移以及上皮转化中发挥调控作用[5]。因此，本研究以胃癌SGC-7901细胞为研究对象，探讨lncRNA 01287是否能通过调节miR-298表达，从而调控STAT3信号通路，在肝癌中发挥作用。
1.1 细胞系
人胃癌SGC-7901细胞购自中国科学院上海细胞库。
1.2 试剂与仪器
LncRNA 01287模拟物(mimic)、模拟物阴性对照(mimic-NC)、抑制剂(inhibitor)以及抑制剂阴性对照(inhibitor-NC)购自上海吉玛制药有限公司；
Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；
Transwell小室购自美国Millipore公司；
p-STAT3、STAT3、上皮钙粘蛋白(E-cadherin，E-cad)、神经钙粘蛋白(N-cadherin，N-cad)和波形蛋白(Vimentin)抗体购自美国Abcam公司；
倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司；
多功能酶标仪购自美国MD公司。
1.3 细胞培养与分组
人胃癌SGC-7901细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM的培养基中，培养箱环境为37 ℃、5%CO2，每2天更换一次培养基，显微镜下观察细胞融合度为80%左右时，胰蛋白酶消化，DMEM培养基将细胞制成单细胞悬液，进行传代。将第4代对数生长期细胞随机分为对照组、inhibitor-NC组、inhibitor组、mimic-NC组和mimic组，除对照组外，其余组分别转染inhibitor NC、inhibitor、mimic NC以及mimic，转染24 h后，进行后续实验。
1.4 qRT-PCR法检测细胞中Lnc RNA01287和miR-298的表达水平
离心收集细胞，加入Trizol试剂提取细胞中总RNA，测定RNA浓度和纯度，根据逆转录试剂盒，将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，进行PCR反应，条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行40个循环，2-△△CT法计算Lnc RNA01287和miR-298表达水平，引物序列见表1。
表1 引物序列
1.5 MTT法检测细胞存活率
收集转染后的细胞，DMEM培养基将细胞制成密度为5×104/ml的单细胞悬液，以每孔200 μl接种于96孔板，置于培养箱中培养24 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液50 μl，4 h后弃上清，每孔加入DMSO 150 μl，振荡混合15 min，置于波长为490 nm的酶标仪上，测定吸光度(A)值，并计算细胞存活率，细胞存活率(%)=(实验组A值/对照组A值)×100%。
1.6 划痕实验检测细胞迁移能力
收集转染后的细胞，制成密度为1×106/ml的单细胞悬液，每孔100 μl接种于6孔板，至于培养箱中培养，待细胞密度达80%以上时，用100 μl无菌枪头垂直培养板底部均匀划线，预冷PBS清洗3次，除去细胞碎片，加入无血清培养基，置于培养箱中培养，分别在0 h和24 h拍照测量划痕宽度，细胞划痕愈合率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。
1.7 Transwell实验检测细胞侵袭能力
Matrigel基质胶与无血清DMEM培养基按照1∶3的比例稀释混匀，将100 μl稀释后的基质胶平铺于Transwell小室中，置于恒温培养箱中1 h，使基质胶凝固。收集细胞，调整细胞密度为1×106/ml，在上室中加入细胞悬液100 μl，下室中加入含10%胎牛血清的培养基600 μl，置于培养箱中培养24 h。取出小室，湿棉签将小室上层未迁移细胞拭去，预冷PBS清洗3次，多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色20 min，预冷PBS清洗3次，显微镜下随机取5个视野计数。
1.8 双荧光素酶报告试验检测靶向关系
Targetscan软件进行靶基因预测，构建野生型LncRNA 01287(WT LncRNA 01287)和突变型LncRNA 01287(Mut LncRNA 01287)荧光素酶报告基因质粒，采用Lipofectamine 2000脂质体转染法将野生型和突变型质粒与miR-298 mimic与mimic-NC共同转染如SGC-7901细胞，48 h后收集细胞，测定荧光素酶活性，结果以海参荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度的比值反映LncRNA 01287与miR-298的结合强度。采用同样的方法构建WT-STAT3和Mut-STAT3质粒，将两种质粒与miR-298 mimic与mimic-NC共转染入SGC-7901细胞，检测miR-298与STAT3的靶向关系。
1.9 蛋白印迹法检测细胞中各蛋白表达
预冷PBS清洗细胞3次，加入RIPA裂解液裂解细胞，离心收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，调整蛋白浓度，加入上样缓冲液，煮沸变性。浓缩胶每孔加入蛋白样品20 μl，80 v电泳直至蛋白样品到达分离胶，120 v电泳直至蛋白样品到达分离胶底部。0.3 A恒流湿转2 h，取出PVDF膜，TBST洗膜3次，室温封闭1 h，p-STAT3、STAT3、E-cad、N-cad、Vimentin以及GAPDH抗体(1∶1000)4 ℃过夜，TBST洗膜3次，二抗(1∶5000)室温孵育1 h，ECL法显色，Image J分析条带灰度值，目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值为目的蛋白相对表达量。
1.10 统计学分析
2.1 qRT-PCR检测结果
LncRNA 01287和miR-298表达水平组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组、inhibitor-NC组以及mimic-NC组LncRNA 01287和miR-298表达水平比较，差异无统计学差异(P>0.05)；
与mimic-NC组比较，mimic组LncRNA 01287表达水平升高，miR-298表达水平降低；
与inhibitor-NC组比较，inhibitor组LncRNA 01287表达水平降低，miR-298表达水平升高，见表2。
表2 各组细胞中LncRNA 01287和miR-298表达水平比较
2.2 细胞存活率检测结果
细胞存活率组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与inhibitor-NC组比较，inhibitor组细胞存活率降低(P<0.05)；
对照组、mimic-NC组、mimic组以及inhibitor-NC组细胞存活率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。
表3 各组细胞存活率比较
2.3 划痕实验检测结果
划痕愈合率组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与mimic-NC组比较，mimic组划痕愈合率升高(P<0.05)；
与inhibitor-NC组比较，inhibitor组划痕愈合率降低(P<0.05)；
对照组、mimic-NC组以及inhibitor NC组划痕愈合率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。
表4 各组细胞划痕愈合率比较
2.4 Transwell实验检测结果
侵袭细胞数组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与mimic-NC组比较，mimic组侵袭细胞数增多(P<0.05)；
与inhibitor-NC组比较，inhibitor组侵袭细胞数减少(P<0.05)；
对照组、mimic-NC组以及inhibitor NC组侵袭细胞数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表5。
表5 各组侵袭细胞数比较
2.5 LncRNA 01287和miR-298 mimic的靶向关系
SGC-7901细胞转染WT LncRNA 01287和miR-298 mimic后，相对荧光素酶活性明显降低；
而转染Mut LncRNA 01287和miR-298 mimic后，相对荧光素酶活性无影响，见图1、表6。
图1 LncRNA 01287和miR-298的结合位点和突变位点
表6 相对荧光素酶活性比较
2.6 miR-298和STAT3的靶向关系
SGC-7901细胞转染WT STAT3和miR-298 mimic后，相对荧光素酶活性明显降低；
而转染Mut STAT3和miR-298 mimic后，相对荧光素酶活性无影响。见图2、表7。
图2 STAT3和miR-298结合位点和突变位点
表7 相对荧光素酶活性比较
2.7 蛋白印迹法检测结果
p-STAT3、N-cad、E-cad和Vimentin蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与mimic-NC组比较，mimic组p-STAT3、N-cad和Vimentin蛋白相对表达量升高，E-cad蛋白相对表达量降低(P<0.05)；
与inhibitor-NC组比较，inhibitor组p-STAT3、N-cad和Vimentin蛋白相对表达量降低，E-cad蛋白相对表达量升高(P<0.05)；
对照组、mimic-NC组以及inhibitor-NC组各蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。STAT3蛋白相对表达量组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表8，图3。
表8 各组细胞中蛋白相对表达量比较
胃癌是临床上常见的高度异质性的消化道肿瘤，严重威胁人类生命健康，因其发病具有隐匿性，因此大多数患者发现时已处于进展期[6]。进展期胃癌伴发肿瘤转移是临床上治疗的难点，肿瘤细胞转移是一个多基因、多步骤以及多阶段的复杂过程，肿瘤细胞脱离原发灶，运动至细胞外基质、邻近组织器官或远处器官生长成肉眼可见的实质性肿瘤细胞团的过程。胃癌术后化疗常存在较多不良反应，造成患者五年生存率较低，预后效果不理想[7]。因此，深入研究胃癌的发病机制，寻找调控胃癌细胞侵袭和转移的关键分子对临床治疗胃癌，提高患者生存率至关重要。
A为对照组；
B为mimic-NC组；
C为mimic组；
D为inhibitor-NC组；
E为inhibitor组。
本研究通过过表达或抑制胃癌细胞SGC 7901中lncRNA 01287的表达，MTT法检测细胞活性、划痕实验检测细胞迁移能力以及Transwell实验检测细胞侵袭能力，结果显示：细胞中lncRNA 01287过表达后划痕愈合率升高，侵袭细胞数增多，抑制细胞中lncRNA 01287的表达后细胞存活率和划痕愈合率降低，侵袭细胞数减少。结果表明：lncRNA 01287可促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。近年来，miR-298被认为与多种肿瘤的发生发展有关，研究发现，miR-298靶向PTEN在结肠癌细胞的迁移和侵袭中发挥作用[8]。Rui等[9]研究发现lncRNA GAS6-AS2直接靶向抑制miR-298表达，因此降低膀胱癌细胞的增殖活性，抑制肿瘤的生长。沉默环状RNA0005797靶向调节miR-298抑制子宫内膜癌进展[10]。本研究双荧光素酶报告基因显示，lncRNA 01287靶向作用于miR-298，qRT-PCR结果显示：过表达SGC 7901细胞中miR-298表达后miR-298表达水平降低，而抑制lncRNA 01287表达可上调miR-298表达。结果表明：lncRNA 01287靶向抑制miR-298表达。
STAT3是细胞内重要的转录因子之一，参与调控细胞生长、分化及细胞周期等过程，是多种恶性肿瘤发生的重要因子之一，参与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[11]。研究发现，p-STAT3表达水平与胃癌患者的不良预后及胃癌分化程度，TNM分期以及淋巴结转移和肿瘤浸润深度密切相关[12]。miR-223通过靶向抑制胃癌细胞中STAT3蛋白的转录活性，从而减弱胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力[13]。本研究双荧光素酶报告实验结果显示miR-298可直接靶向作用于STAT3。蛋白印迹法结果显示：lncRNA 01287过表达后，p-STAT3蛋白表达升高，抑制lncRNA 01287表达后，p-STAT3蛋白表达降低。结果表明：lncRNA 01287通过抑制miR-298表达，激活STAT3的转录活性。上皮间质转化是上皮细胞逐渐失去上皮表型，而获得间质细胞表型的现象，是肿瘤细胞发生浸润和转移的重要原因。研究发现，外源性17肽胃泌素激活STAT3信号通路，下调E-cad，上调N-cad和Vimentin蛋白表达，诱导胃癌细胞SGC-7901发生上皮间质转化[14]。幽门螺杆菌通过激活IL-6/STAT3信号通路诱导胃癌细胞上皮间质转化的形成[15]。本研究结果显示：过表达lncRNA 01287的细胞中E-cad蛋白表达降低，N-cad和Vimentin蛋白表达升高，抑制lncRNA 01287表达的细胞中E-cad蛋白表达升高，N-cad和Vimentin蛋白表达降低。结果表明：lncRNA 01287诱导细胞发生上皮间质转化。
综上所述，lncRNA 01287上调可增强胃癌细胞增殖、迁移和侵袭活性，其可能是通过调控miR-298/STAT3信号通路发挥作用，为临床治疗胃癌提供理论依据。
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