李玮浩 温丰标 崔广晖
食管癌作为全世界范围内具有很高发病率且患者通常预后较差的癌症之一，而我国食管癌人数约占全球数量的一半，特别是在河北等地区的发病率最高。尽管的断食管癌及后期治疗在临床上取得了不错的进展，但多数患者治疗后的预期并不能让人满意。检测食管上脱落的细胞是筛查食管癌额重要手段之一，但因其具有一定的创伤性，无法在广大人群筛选使用。寻找稳定、可靠且无创的早期筛查指标已成为食管癌诊疗中亟待攻克的难题之一。
微小RNA(microRNA，miR)是一类长度约为22核苷酸的非编码RNA，通过调控并参与人体的各个生理及病理相关过程，并与肿瘤的增殖、侵袭及转移密切相关[1-2]。近年有报道指出miR-148b参与多个消化道肿瘤发生、发展，如肝癌患者体内miR-148b存在异常表达，且与肝癌的增殖、转移和侵袭等过程密切相关[3]。癌胚抗原(CEA)是一个较广谱的肿瘤标志物，已被证实在食管癌中有异常表达。基质金属蛋白酶-1(MMP-1)作为人体中的水解细胞外基质的酶，参与调控肿瘤细胞生长转移等过程[4]。马新义等[5]指出，MMP-1蛋白水平在食管鳞状类细胞癌中高，且MMP-1水平与食管鳞状类细胞癌的浸润深度、淋巴结转移和临床分期相关，可作为判断食管鳞状细胞癌恶性生物学行为的重要参考指标。本研究通过对比健康人群与食管癌体内的miR-148b、MMP-1与CEA水平差异，分析这些指标和食管癌临床病理特征间的关系及在食管癌的临床价值。
1.1 研究对象
选取2018年6月至20121年6月治疗的90例食管癌患者为观察组，男女比例为58∶32，平均年龄在(52.2±4.3)岁；
食管癌位置中上段为15例，中段为52例，下段为23例；
食管癌中20例为早期患者，70例为中晚期患者；
78例为鳞癌，7例为腺鳞癌，5例为腺癌；
16例为低分化,64例为中分化，10例为高分化。患者全部是第一次住院并经过内镜确诊。依据患者的病理学资料评估其食管癌具体的分化情况，分期则依据患者的影像学检查、临床特点和内镜下结果予以判断。对照组为同期在我院实施体检的100例健康成年人，男女比例为62∶38，平均年龄在(52.9±3.8)岁。全部的对象均排除其他脏器恶性肿瘤，合并糖尿病，伴有自身免疫性疾病或心脑血管疾病。本研究经医院伦理委员会批准。
1.2 资料采集与样本检测
由专业研究人员对受试者性别、年龄等一般信息进行记录。受试者在入院当天由专业的护士采用抗凝管采集10 ml静脉血，采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方式测定血浆中的miR-148b和GAPDH内参基因浓度；
操作步骤严格按照说明书实行，反应总体系为：20 μl，其中上下游的引物均为0.8 μl，Mix 10 μl，cDNA为 2 μl，最后添加6.4 μl DEPC。循环条件设置为：95 ℃条件下5 min变性；
接下来进行45个循环(95 ℃条件下30 s，60 ℃条件下30 s，72 ℃条件下30 s)，每组增加复孔3个。检测过程中所用引物序列如下：miR-148b上游引物：5"-TACAACCACTGCACTACCTG-3"，下游引物：5"-TGGAATGCTTGAAGGCTGCT-3"；
GAPDH 上游引物：5"-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3"，下游引物：5"-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3"。
采用2-ΔΔCt法将miR-148b相对的表达量计算出来，△Ct值=样本和内参基因的Ct值之差。
应用化学发光法和酶联免疫吸附法(ELISA)测定MMP-1、CEA 的浓度，其中CEA为化学发光法(上海百蕊生物科技有限公司)；
肿瘤的高、低值质控品则购自英国朗道公司，质控的评估标准则依据Westgard分析。
MMP-1为酶联免疫吸附法(ELISA)测定。全部标本稀释100倍后分别加入微孔板，然后加抗体在室温情况下予以40 min孵育(分别加10 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL浓度的3个标准品以及阳、阴性对照)，5次洗板后，在避光情况下加具有酶标记的单抗在室温情况下40 min孵育，接下来5次洗板，加入底物等待15民的反应后在终止，于Nanodrop ND 2000型分析仪(购自美国赛默飞世尔公司)分析吸光值(A)。
分别计算血浆miR-148b、MMP-1和CEA的批内、批间变异系数(CV)情况，用以判定本次操作的精确度及重复性。
1.3 试剂与仪器
实验过程中用到的仪器以及试剂由：H-1850R型的4 ℃离心机(购自中国湘仪集团)；
C1000型的RT-qPCR仪(购自美国Bio-Rad公司)；
逆转录试剂盒(批号：
16072513，中国Takara公司)；
提取血浆RNA的试剂盒(批号：BC1814115OA，购自中国Bioteke公司)；
RSV1型的PCR仪(购自美国 Bio-Rad公司)；
SYBR Green Mixture(批号：MIC102608，中国康为世纪公司)；
UniCel DxI 800型的生化分析仪(购自美国贝克曼库尔特公司)。
1.4 统计学分析
2.1 两组血清miR-148b、MMP-1与CEA表达水平对比
观察组与对照组间的性别、年龄、吸烟史等均无差异(P>0.05)。观察组血清miR-148b、CEA和MMP-1水平均较对照组高，且差异明显(P<0.05)，见表1。血清miR-148b、CEA和MMP-1检测的批内CV值是3.7%、2.9%和4.5%，批间CV值是3.9%、3.3%和4.6%，均小于5%，表明本次操作的精确度、重复性较好。
表1 两组一般资料及血清miR-148b、CEA与MMP-1水平比较
2.2 miR-148b、CEA与MMP-1水平与食管癌临床病理特点的关系
食管癌血浆miR-148b与MMP-1水平与其分化程度、分期和组织学类型呈明显相关性(P<0.05)。且miR-148b与MMP-1水平在食管腺鳞癌、中晚期食管癌和低分化患者中上升最明显，而血浆CEA与食管癌分化程度、分期和组织学类型无关(P>0.05)。此外三者与食管癌患者的性别、年龄、饮酒史等均无相关性(P>0.05)，见表2。
表2 血浆miR-148b、CEA与MMP-1水平与食管癌临床病理特征的关系
2.3 血浆miR-148b、CEA与MMP-1水平对食管癌的鉴别诊断
ROC曲线结果发现，血浆miR-148b、CEA与MMP-1在区分食管癌与非食管癌的AUC分别是0.890(95% CI：0.852～ 0.921，P<0.001)、0.654(95% CI：0.504～ 0.807，P=0.012)和0.814(95% CI：0.742～0.908，P<0.001)；
而各个指标的约登指数处于最大值时所对应的特异度和灵敏度是：84.0%/83.2%、80.3%/32.5%和82.1%/77.6%；
诊断界值是16.4、6.3 ng/ml和24.8 pg/ml。当联合miR-148b、CEA与MMP-1时，logistics回归将上述miR-148b、CEA与MMP-1这3个指标拟合后得到变量-“PRE-1值”，并带入ROC曲线分析，发现联合3种指标在区分食管癌与非食管癌的AUC为0.902(95% CI：0.850～0.964，P<0.001)，灵敏度为81.1%，特异度为92.4%，见图1。
图1 miR-148b、CEA与MMP-1对食管癌的鉴别诊断
2.4 miR-148b、CEA与MMP-1水平对食管癌风险的预测价值
单因素分析发现，高miR-148b、CEA与MMP-1水平是造成食管癌的危险因素。多因素结果显示，在校正年龄、性别、饮酒、吸烟等因素影响后，高miR-148b与MMP-1水平仍是诱发食管癌的独立危险因素，见表3。
表3 血浆miR-148b、CEA与MMP-1水平对食管癌风险的预测价值
食管癌作为全世界范围内比较常见的上消化系统恶性肿瘤，极大地威胁了全球人民的的健康。生物敏感标志物作为尿液、血液及组织中可以用于诊断早期疾病情况的指标，具有操作便捷、创伤小、成本低等优势，可诊断并评估疾病具体情况[6-7]。其在人体中的浓度改变情况可以判断疾病具体进展，最好的情况下，生物敏感标志物需要有较高的诊断早期肿瘤的敏感性及特异性，其在非肿瘤组织中浓度并不上升。显然，挑选更多高价值的生物敏感标志物是目前临床诊断食管癌的热点，对早期诊断并针对性治疗食管癌意义重大。
CEA是食管癌的辅助诊断指标之一，对食管癌的早期诊断有一定价值。ukaszewicz等[8]的研究发现，利用化学发光法检测血清CEA在区分食管癌患者与健康人群中的敏感性/特异性分别为17.0%/93.0%，提示血清CEA对于食管癌诊断敏感性较低。在本次研究中，CEA区分食管癌及健康人群的敏感性/特异性分别是32.5%/80.3%，敏感性较低，与之前的报道基本一致[8]。但CEA作为食管癌诊断的传统指标，尚存在敏感性不足的问题。
miR是新型和基因调控相关的因子，能在转录后将靶基因具体表达过程以及蛋白质的翻译过程抑制，已被证明了在胃癌[9]和神经胶质瘤[10]等多种肿瘤中存在异常表达。miR-148b是近年研究发现的重要的原癌基因。高表达的miR-148b通过对直接靶基因如抑癌基因ROCK1转录结束后可以负性调控并抑制癌细胞凋亡，加速细胞的增殖和迁移[3]。Chen等[3]通过体外培养肝癌细胞并经脂质体转染含有si-miR-148b的质粒，下调肝癌细胞中miR-148b的表达水平，观察到下调miR-148b可显著降低肝癌细胞迁移能力。然而，关于miR-148b在食管癌中的机制研究尚未见报道。在本次研究中，我们发现血浆miR-148b在食管癌患者中水平显著高于健康女性，且在食管腺鳞癌、中晚期食管癌和低分化食管癌患者中上升最明显，本次研究结果通过大样本量的检测对前期基础研究结果进行了验证，证实血浆miR-148b的异常表达在食管癌早期鉴别诊断及疾病进展程度具有一定价值。
国内外近年来很多的研究均证实了血浆中的MMP-1在肿瘤的微环境重塑、加速肿瘤细胞向远处转移和诊断并治疗肿瘤中具有很高的应用价值[11-12]。早前的相关报道指出，胃癌患者血浆内的MMP-1基因表达相较于健康人群明显上升，并浓度增加的MMP-1和胃癌细胞向远处的转移相关[11]。Benson等[12]研究亦发现癌组织内的MMP-1基因较癌旁组织的表达更高。这些研究都证实了MMP-1调控肿瘤发生和发展。本研究试我们第一次利用大样本检测食管癌患者血浆内的MMP-1表达差异大，且食管腺鳞癌、中晚期食管癌与低分化食管癌患者中的血浆MMP-1浓度上升最多，与前期的试验相互对应[11-12]。
ROC曲线分析显示，血浆miR-148b与MMP-1在区分子食管癌与对照组的灵敏度/特异度分别为83.2%/84.0%和77.6%/82.1%，均高于单独应用CEA；
而联合miR-148b、CEA与MMP-1在区分食管癌和对照组特异度明显上升，达到92.4%，提示联合应用血浆miR-148b、CEA与MMP-1在食管癌鉴别诊断中具有较高价值。Logistic回归多因素分析显示，在校正性别、年龄、饮酒、吸烟等因素影响后，血浆高miR-148b和高MMP-1水平仍是食管癌发生的独立危险因素。然而，本次研究仍有如下不足：(1)本次研究纳入的患者均挑选自本院，过于集中的患者来源可能会对本次研究结果产生了偏倚的影响，今后可以从多中心的队列进一步验证相关的结果；
(2)本研究纳入90例食管癌患者，纳入病例的数目仍然存在一定的限的，后期需要增加更多的样本量进行研究证实血浆miR-148b、CEA与MMP-1在我国食管癌患者中的临床价值。
综上，通过本次研究我们发现联合血浆miR-148b、CEA与MMP-1在食管癌鉴别诊断中临床意义重大，有望为食管癌患者的诊疗提供新的途径与思路。
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