唐木兰，曾春晖，黄鑫波，王溢，朱海滨，杨柯（广西中医药大学，南宁 530000）
急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是指继发于非心源性呼吸窘迫的低氧血症-原发性肺水肿。ALI随着病情进一步发展为更严重的急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），病死率高达30%～50%[1-2]。巨噬细胞在炎症发生过程和免疫系统激活起到关键作用，其具有可塑性和功能多样性，可以极化为M1或M2亚型。M1 型巨噬细胞与促炎有关，而 M2型巨噬细胞则与抗炎、伤口愈合及纤维化作用相关[3-4]。已有研究证实，在ALI/ARDS急性渗出期M1型巨噬细胞的数量明显增加，因此巨噬细胞可被作为治疗ALI/ARDS的靶细胞。
藤茶[Ampelopsis grossedentata（Hand-Mazz）W.T.Wang]系葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄的嫩茎叶，含有丰富的黄酮类化合物，以双氢杨梅树皮素为主[5]。课题组前期实验已证明藤茶能显著增加小鼠胸腺、脾脏等免疫器官的重量[6-7]，具有增强非特异性免疫功能和体液免疫功能的作用；
前期研究也表明双氢杨梅树皮素具有抵抗博来霉素诱导的小鼠肺纤维化作用，改善呼吸功能衰退的症状[8]。本文构建“化合物-靶点-通路”网络，提示双氢杨梅树皮素可通过PI3K-Akt信号通路改善ALI，且进行巨噬细胞极化差异基因KEGG通路富集分析发现，巨噬细胞的极化也与PI3K/Akt信号通路密切相关，因此后续实验选取PI3K/Akt信号通路的主要蛋白进行验证。网络药理学结合体外实验考察双氢杨梅树皮素对ALI小鼠肺部调节巨噬细胞极化的功能及蛋白表达进行测定，为后续探讨双氢杨梅树皮素调节巨噬细胞极化改善ALI/ARDS的机制研究提供参考。
1.1 仪器与试药
双氢杨梅树皮素[广西中医药大学中药化学实验室提供，从藤茶（Ampelopsis grossedentata（Hand-Mass）W.T.Wang）的茎叶中分离、纯化得到，为白色粉末状，纯度≥98%]。醋酸地塞米松（批号：2201222，安徽金太阳生化药业有限公司）；
脂多糖（LPS，批号：12101031，北京索莱宝科技有限公司）；
流式抗体PE-F4/80、FITC-CD11b、CD86-APC、PE-Cy7-CD206（批号分别为12-4801-82、11-0112-82、17-0862-82、25-2061-82，美国赛默飞世尔科技公司）；
PI3K抗体、Akt抗体（批号分别为2893S、4691S，Cell Signaling Technology），β-Actin抗体（批号：00078629，Proteintech）；
10%SDSPAGE凝胶配制盒（批号：02581100，上海雅酶生物科技有限公司）。BD LSRFortessa流式细胞分析仪（美国BD公司）。
1.2 实验动物
SPF级KM小鼠36只，雌雄各半，体质量（20±2）g [湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2019-0004；
动物使用许可证号：SYXK（桂）2019-0001]。
1.3 数据库
PubChem数据库（https：//pubchem. ncbi.nlm.nih. gov/），GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/），OMIM数据库（https：//www.omim.org/），Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/），STRING数据库（https：//cn.string-db.org/），Metascape数据库（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），微生信（https：//www.bioinformatics.com.cn/login/）在线作图平台，GEO数据库（https：gene expression omnibus），DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）。
2.1 网络药理学
应用PharmMapper、GeneCards和OMIM数据库检索双氢杨梅树皮素的预测靶点和ALI/ARDS相关疾病靶点，两者取交集，上传至STRING数据库，根据Degree≥16、Closeness Centrality≥0.524、Betweenness Centrality≥0.002筛选靶点并导入Cytoscape 3.7.1构建蛋白互作（PPI）网络，获得41个潜在核心靶点。利用Metascape数据库对核心靶点进行KEGG通路富集分析，主要通路包括PI3K-Akt、雌激素信号通路、内分泌抵抗，并运用Cytoscape软件构建“化合物-靶点-通路”网络图，结果见图1。
图1 “化合物-靶点-通路”网络图Fig 1 “Compound-target-pathway” network
根据筛选出的6个核心靶点与双氢杨梅树皮素进行对接。在PubChem数据库中获取“ampelopsin”的化学结构（PubChem CID：25184515），利用AutoDock软件进行分子对接计算，ΔG值越小表示结合能越高，越容易与受体结合，对接结果见表1，与双氢杨梅树皮素对接的相互作用见图2。其中MMP9、IGF1与双氢杨梅树皮素的结合能力较强，结合能分别为－7.77 kJ·mol－1、－7.27 kJ·mol－1。
表1 双氢杨梅树皮素与关键靶点的分子对接结果Tab 1 Molecular docking of ampelopsin with key target
图2 蛋白与双氢杨梅树皮素对接的相互作用示意图Fig 2 Interaction between protein and ampelopsin
2.2 巨噬细胞差异基因筛选及KEGG通路分析
从GEO数据库中获得GSE95405基因芯片数据集。此数据为GPL570平台Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array基因芯片，选取经干扰素-γ（INF-γ）和LPS诱导巨噬细胞M1 型极化的3例样本，白细胞介素-4（IL-4）诱导巨噬细胞M2型极化的3例样本，共获得3980个差异基因。其中1682个基因在M1型巨噬细胞中表达上调，在M2型巨噬细胞中表达下调；
2298个基因在M1型巨噬细胞中表达下调，在M2型巨噬细胞中表达上调。利用GEO2R分析芯片数据的差异表达基因，过滤条件为P＜0.001及差异倍数|logFC|＞2。利用DAVID数据库将筛选的差异基因导入 DAVID 在线数据库进行 KEGG 通路富集分析，按照P值排序，主要包括PI3K-Akt、细胞因子-细胞因子-受体相互作用等信号通路，选取前20条信号通路可视化，富集通路结果见图3。
图3 差异基因KEGG通路富集分析Fig 3 KEGG pathway enrichment analysis of differential gene
2.3 动物实验
2.3.1 动物分组与给药方法 将36只SPF级KM小鼠随机分为6组：正常对照组，模型组，地塞米松组（5 mg·kg－1），双氢杨梅树皮素高、中、低（400、200、100 mg·kg－1）剂量组，每组6只。正常对照组小鼠气管内滴注等体积生理盐水，其余各组小鼠气管内滴注8 mg·kg－1的LPS建立ALI小鼠模型，双氢杨梅树皮素各剂量组和地塞米松组灌胃相应剂量的药物，正常对照组和模型组灌胃等体积生理盐水，连续3 d。
2.3.2 肺泡灌洗液的收集与巨噬细胞亚型的检测 肺泡灌洗液用1 mL注射器向气管内缓慢注入0.5 mL预冷的生理盐水灌洗小鼠肺组织，慢慢回抽灌洗液，反复灌3次，每遍冲洗3次，回收肺泡灌洗液（BALF）。BALF 4℃、1000 r·min－1离心10 min，收集细胞沉淀。向细胞悬液中加入1 mL的红细胞裂解液，颠倒混匀放置15 min，期间轻轻混匀2次，红细胞裂解后，溶液为清亮透明液体；
4℃、1000 r·min－1离心10 min，小心倒去上清液，获取细胞沉淀，PBS重悬细胞；
每管加入FITC-CD11b、PEF4/80、CD86-APC和PE-Cy7-CD206抗体。冰上避光孵育30 min，孵育完成后，每支流式管加入1 mL PBS洗涤细胞；
4℃、1000 r·min－1离心5 min，洗去未结合或者非特异性结合的流式抗体，重复2次；
加入1 mL PBS重悬细胞，过滤到流式管中，得到流式抗体染色后的小鼠BALF单细胞悬液，上机检测。
2.3.3 双氢杨梅树皮素诱导肺巨噬细胞向M2型极化 流式细胞术检测小鼠BALF中巨噬细胞标志物F4/80和CD11b、M1型标志物CD86以及M2型标志物CD206。如图4和表2显示，与正常对照组相比，模型组中表达F4/80＋CD11b＋CD86＋的M1型巨噬细胞数量显著增加（P＜0.001），而F4/80＋CD11b＋CD206＋的M2型巨噬细胞数量显著减少（P＜0.001）；
双氢杨梅树皮素干预后F4/80＋CD11b＋CD206＋的M2型巨噬细胞数量显著增加（P＜0.01），且M1/M2的比例也明显降低（P＜0.01）。由此可见，双氢杨梅树皮素可促进肺巨噬细胞向M2型极化。
表2 双氢杨梅树皮素对小鼠BALF中巨噬细胞极化的影响(%，x±s，n＝6)Tab 2 Effect of ampelopsin on macrophage polarization in BALF(%，x ±s，n＝6)
图4 双氢杨梅树皮素对小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞极化的影响Fig 4 Effect of ampelopsin on macrophage polarization in BALF
2.3.4 双氢杨梅树皮素降低小鼠肺组织PI3K、Akt蛋白的表达 取小鼠肺组织以1∶1比例（1 g组织 ∶1 mL裂解液）使用匀浆机进行研磨，4℃、15 000 r·min－1离心10 min，取上清液，用BCA试剂盒进行蛋白定量。采用SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒制备10%的PAGE胶，上样，电泳，PVDF转膜，快速封闭液封闭40 min后加一抗，其中内参β-Actin为1∶5000，PI3K/Akt抗体为1∶1000，4℃过夜，TBST洗膜3次，加入二抗1∶5000，常温孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL发光液显影，利用Image Lab软件进行灰度值统计得到结果。与正常对照组相比，模型组PI3K、Akt蛋白表达量明显增加；
与模型组相比，双氢杨梅树皮素高剂量组PI3K 蛋白表达量明显降低（P＜0.05），双氢杨梅树皮素各剂量组Akt蛋白表达量显著降低（P＜0.05），结果见图5。
图5 双氢杨梅树皮素对小鼠肺组织PI3K、Akt蛋白表达量的影响（x ±s，n＝3）Fig 5 Effect of ampelopsin on the expression level of PI3K and Akt in the lung（x ±s，n＝3）
2.4 数据处理
本研究数据分析和作图采用软件为SPSS 20和GraphPadPrism8.0，结果用x± s表示。组间差异使用单因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05为差异具有统计学意义。
本研究通过网络药理学发现AKT1、ALB等为双氢杨梅树皮素改善ALI/ARDS的关键靶点，AKT1是肺内皮细胞中AKT的主要亚型，对内皮细胞迁移和血管渗漏预防具有重要作用，敲除AKT1会降低层黏连蛋白和基底膜厚度，造成血管通透性增加，从而加重肺损伤[9-10]。KEGG通路分析表明，双氢杨梅树皮素改善ALI/ARDS与PI3K/Akt、雌激素等信号通路相关，其中PI3K/Akt信号通路是细胞内重要的信号转导通路之一，调控细胞分化、增殖和凋亡等功能，通过激活μ阿片类受体（MOR）抑制PI3K/Akt信号通路可以改善LPS造成的ALI/ARDS[11]。黄芩苷通过降低PI3K/Akt信号通路的活化水平可以诱导巨噬细胞向M2型极化和抑制M1型极化[12]。另外，相关研究发现，雌激素能显著促进巨噬细胞向M2型极化[13-14]，与本研究通路分析结果一致，雌激素信号通路作为调节M2型极化的重要通路之一。课题组前期研究发现，双氢杨梅树皮素能抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，降低肺泡内IL-6和IL-1β等促炎细胞因子的释放，同时降低单核-巨噬细胞的比例改善ALI。流式细胞术实验结果显示，双氢杨梅树皮素能明显增加M2型巨噬细胞极化和降低M1/M2的比例，Western blot结果表明模型组小鼠肺组织中PI3K和Akt蛋白表达量明显增加，给予双氢杨梅树皮素干预后，各给药组PI3K和Akt蛋白表达量显著降低，证实双氢杨梅树皮素具有调节巨噬细胞极化改善ALI/ARDS的潜在治疗作用，且作用机制可能是与调节PI3K/Akt信号通路有关。
综上，本研究借助多种生物信息学手段，将双氢杨梅树皮素进行靶点预测、通路分析，联合ALI中免疫细胞-巨噬细胞极化差异表达基因，通过流式细胞术检测M1/M2型巨噬细胞及肺组织中PI3K和Akt的蛋白表达量验证网络药理学预测结果。双氢杨梅树皮素通过降低PI3K和Akt的蛋白表达量调节巨噬细胞极化从而改善ALI。本课题组后续将进一步深入研究双氢杨梅树皮素调控巨噬细胞极化的作用机制，以期为指导通过药物调控巨噬细胞向有利于遏制疾病的方向极化，为疾病的治疗提供新的方法。
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